Молчи, ген, молчи!

Исследователи из Института Дюка (Duke University) для чистки грязной воды от патогенных микробов и вирусов действуют на их РНК и считают, что этот способ поможет решить делему обеспечения незапятанной питьевой водой обитателей государств Третьего мира. Фото: Duke’s Pratt School of Engineering

В протяжении многих десятилетий главной «молекулой жизни» числилась ДНК. И это в общем-то правильное мировоззрение несколько заслоняло ту важную роль, которую в живом организме играет другая схожая молекула — РНК.

Числилось, что для исцеления генетических заболеваний нужно заносить конфигурации в сами гены, другими словами в структуру ДНК.

Ситуация начала изменяться с неких принципиальных открытий конца XX — начала XXI веков, отмеченных Нобелевской премией 2007 года. Мысль оказалась достаточно обычный: если ДНК содержит «вредную» информацию, которую тяжело либо нереально поправить, то эту информацию можно просто не замечать. Для этого нужно только подходящим образом «настроить» ту молекулу, которая её считывает — а это и есть РНК.

Пробы выполнить такую «облегчённую» программку решают на данный момент различные фармакологичекие компании. И хотя проблем, с которыми они уже столкнулись, пока существенно более многочисленны, чем успехи, которыми они могут повытрепываться, результаты их исследовательских работ внушают оптимизм.

Молчание — золото

Верно сконструированный интерферирующий кусок РНК может практически «выключить» ненадобный ген и приостановить тем развитие заболевания на самой ранешней стадии. Интерферирующие РНК окрестили siRNA (Small interfering RNA), и в 2006 году за открытие этого парадокса была вручена Нобелевская премия по физиологии и медицине.

1-ое лечущее средство на базе РНК было одобрено к клиническому применению ещё в 1998 году. Это фомивирзен (торговое заглавие «Витравен»). Сейчас продукт интенсивно употребляют для борьбы с цитомегаловирусной заразой у нездоровых со сниженным иммунитетом, в том числе нездоровых СПИДом. «Витравен» связывается с одним из главных генов цитомегаловируса, останавливая его экспрессию, и подавляет размножение вируса.

За первой победой последовали клинические тесты других фармацевтических препаратов. Так, в 2006 году, спустя 8 лет после открытия парадокса РНК-интерференции, южноамериканская лекарственная компания Sirna Therapeutics начала тесты нового лекарства, цель которого — исцеление возрастной слепоты, так именуемой возрастной макулярной дегенерации сетчатки. Болезнь вызвана неконтролируемым ростом кровеносных сосудов в центральной части сетчатки и приводит к потере зрения. Раз в год в мире этот диагноз ставят более чем полумиллиону человек, и это только зарегистрированные случаи.

Но продукт, который тестировала компания, не был одобрен. Неудачной оказалась и попытка, предпринятая американской компанией OpkoHealth. Сделанный ими продукт прошёл фазу II клинических испытаний, но для него был показан неспецифический эффект: лечущее средство действовало не только лишь на белковый синтез, да и вызывало иммунный ответ. На сегодня для исцеления возрастной слепоты одобрено только одно лечущее средство на базе интерферирующей РНК — «Макуген». Его вводят инъекционно в глазное яблоко, так что лечущее средство действует локально, там, где его действие нужно.

Приблизительно так увидит сцену с мальчуганами человек, страдающий возрастной макулярной дегенерацией сетчатки. Фото: National Eye Institute, National Institutes of Health

Глазное яблоко — не единственный «удобный» орган для точечного лекарственного воздействия. Компания Alnylam Pharmaceuticals начала фазу III клинических испытаний лекарства с интерферирующей РНК, которое подразумевается использовать в виде аэрозоли либо ингалятора. Мишень — эпителиальные клеточки в лёгких. Воздействие нового продукта создано для исцеления синцитиальной вирусной инфекции, которая в особенности всераспространена у грудничков и малеханьких малышей.

Ещё один пример недуга, с которым пробуют биться при помощи РНК-интерференции, — болезнь Хантингтона. Ею занимается Филлип Саморе (Phillip Zamore), доктор мед факультета Массачусетского института (University of Massachusetts Medical School). Болезнь Хантингтона — на генном уровне обусловленная дегенерация нервной системы. 1-ые симптомы возникают в 35–50 лет, когда в нервных клеточках нарушается структура белка хантингтина. Физиологическая функция этого белка неведома, но у нездоровых людей форма строения его молекулы нарушена, и он становится ядовитым для нервных клеток. В опытах Саморе показал, что инъекции мышам siRNA, которая останавливает экспрессию неверного белка, снимают симптомы заболевания.

Одна из сложностей с разработкой препаратов с РНК-интерференцией заключается в том, что хотя интерферирующая РНК перекрывает считывание определенного гена, происходит это по всему телу, в клеточках всех органов. Любая клеточка человеческого тела несёт генетическую информацию, которой довольно, чтоб развить новый организм с нуля. Но формирование определенных органов и тканей находится в зависимости от того, какие гены работают в том либо ином месте и с какой силой происходит считывание генетической инфы. Чтоб получить неплохой терапевтический эффект, нужно, чтоб siRNA действовала на определенный ген в определенном органе. Пока же она повлияет на считывание гена по всему телу, потому затрагивает многие органы и ткани, оказывая побочное действие.

Не считая этого, многие заболевания требуют системного вмешательства. Если мы говорим о разработке лекарства для глаз либо лёгких, то тут всё просто: лечущее средство можно закапать в глаз либо ингалировать в легочные пути. Чтоб одолеть, например, метастазы рака либо гипертонию (которые сами по для себя не локализованы), требуется системное введение лекарства — инъекция в кровь, чтоб лечущее средство дошло во все органы и ткани. Но если мы что-то вводим в кровоток, то кровь разносит это по всему телу, не держит снутри сосудов, лечущее средство просачивается в капилляры и через их проницаемые стены возможно окажется в органах и тканях тела. Тут воздействие на считывание гена не нужно, вот и выходит побочный эффект.

Не так издавна компания Alnylam Pharmaceuticals объявила о получении разрешения на тесты на людях интерферирующей РНК для исцеления гипертонии и опухолевых процессов в печени. Подготовительные тесты на мышах и обезъянах позволяют возлагать, что и системное введение siRNA может быть действенным без ненужных побочных последствий.

При использовании РНК-интерференции очень принципиально установить, имеет ли болезнь полиморфные участки гена. Дело в том, что один и тот же ген у различных людей может «звучать» по-разному, последовательность строй кирпичиков ДНК — нуклеотидов — может различаться (хотя в итоге ген делает у всех одну и ту же функцию). Таковой полиморфизм, личные маленькие варианты в составе ДНК какого-нибудь гена, — реальная «головная боль» для докторов, ведь siRNA сотворена, чтоб узнавать и повлиять на строго определенную последовательность нуклеотидов, а когда возникает полиморфмизм, siRNA может не выяснить свою мишень, и лечущее средство будет неэффективным. В таком случае остаётся только делать личный генетический анализ для каждого пациента и на его базе синтезировать уникальное лечущее средство. Но это очень недешево.

Не siRNA единой

Кроме siRNA учёных завлекает и другой класс — микроРНК, малые ингибирующие РНК (miRNA). На сегодня понятно более восьми тыщ микроРНК, которые сами по для себя не несут информацию о гене, но регулируют его экспрессию (считывание генетической инфы) и выработку на биологическом уровне активных веществ. Основная трудность — установить точную функцию определенной микроРНК.

МикроРНК может связаться с участком, где начинается экспрессия гена, тогда и экспрессия станет неосуществимой. В итоге белок, который кодируется этим геном, закончит синтезироваться. К примеру, если микроРНК перекрывает считывание гена, ответственного за выработку организмом гормона инсулина, то на теоретическом уровне можно синтезировать и ввести в организм маленькую молекулу РНК, которая содержит комплиментарные нуклеотиды. Такие комплиментарные нуклеотиды связываются с нуклеотидами микроРНК. МикроРНК не может сесть на ген, и соответственно, она не перекрывает эксперссию гена, выработка инсулина возрождается и на теоретическом уровне человек излечивается от диабета.

1-ые результаты перспективные. Так, стало понятно, что miR214 отвечает за выработку инсулина поджелудочной железой. Согласно работам доктора Гая Руттера (Guy Rutter) с мед факультета Имперского Института Лондона (Imperial college London), ему удалось при помощи маленьких синтетических молекул инактивировать микроРНК, чтоб повысить продукцию инсулина в организме.

РНК-терапия таит внутри себя много проблем, одна из которых доставка продукта к месту предназначения. Молекулы РНК довольно значительны, потому способны вызывать иммунный ответ. Такие реакции сопровождаются жаром, воспалительными процессами, общим недомоганием. Фото (Creative Commons license): Alden Chadwick

В декабре 2008 года лекарственная компания Regulus Therapeutics объявила об удачных испытаниях на животных синтетических молекул, блокирующих miR-21, которая в огромных количествах находится в сердечко. Блокирование miR-21 предутверждает инфаркты у лабораторных мышей. Предметом пристального исследования этой компании стал и miR-122, нужная для размножения вируса гепатита С.

В конце концов, самый новый и вызывающий много споров подход — это применение маленьких двухцепочечных антигенРНК. В отличие от обычных siRNA, антигенРНК действуют не на информационную РНК, а прямо на ДНК, на промоторы генов (это участки ДНК, которые регулируют активность смежных генов). Детализированный механизм такового деяния пока изучается, но подразумевается, что антигенРНК связывается с участком гена, который регулирует траскрипцию, другими словами перенос генетической инфы с ДНК на РНК. После чего антигенРНК завлекает особенные белки. В конечном итоге на участке гена формируется большой комплекс из РНК и белков, препятствующий нормальному функционированию гена. Беря во внимание, что многие промоторы в обычных критериях ингибированы, задерживают экспрессию гена в подавленном состоянии, то внедрение антигенРНК может заглушить воздействие промотора и раскрепостить экспрессию хотимого гена. На сегодня таковой гипотетичный путь остаётся чуть не единственным для усиления экспрессии гена, в то время как другие виды РНК позволяют только уменьшать активность генов.

Традиционная интерференция — это действие siRNA, другие недлинные РНК (микроРНК и антигенРНК) по механизму деяния в некий степени напоминают интерференцию, но не укладываются в обычную схему. Потому одни учёные считают это тоже интерференцией, другие же — выделяют в отдельные группы.

Подводные камешки и рифы РНК-терапии

Невзирая на перспективные подготовительные результаты, РНК-терапия всё ещё остается в стадии тестов. Основная пробема — сделать РНК размеренной, уберечь от деградации в живых клеточках. Современные препараты на базе РНК остаются в организме от 14 до 30 дней, этого довольно, чтоб получить терапевтический эффект, но для исцеления приобретенных болезней требуется больше времени. На теоретическом уровне некие хим модификации РНК в состоянии сделать её наименее уязвимой для внутренних разрушающих РНК ферментов.

Но на этом трудности не завершаются. Даже очень недлинные РНК не способны пересечь гемато-энцефалический барьер — заслон, защищающий нейроны от проникания из крови разных веществ, которые возможно окажутся ядовитыми для мозга. К огорчению, в разряд таких молекул попадают и куски РНК. Чтоб доставить РНК в мозг, приходится использовать изощрённые приёмы: к примеру, можно использовать непатогенный вектор — молекулу-доставщик, которая, будучи полностью безопасной, способна пробраться в потаённые уголки организма и притащить туда прикреплённую к ней РНК.

Понятно, что аденовирус-содержащие векторы обычно предпочитают нервные клеточки, потому Беверли Дэвидсон (Beverly L. Davidson) из Института Айовы (University of Iowa) употребляет такие векторы для прицельной доставки РНК, которая нарушает работу гена, вырабатывающего белок хантингтин. В опытах на мышах таковой подход даёт отличные результаты, потому последующим шагом будут тесты на обезъянах.

Присутствие магния (на картинке справа) наращивает прикрепляемость молекул РНК друг к другу. Подобные опыты помогают в разработке препаратов РНК-терапии. Фото: NIST

Ещё один увлекательный метод доставки РНК в мозг употребляет группа Свами (Manhjunath N. Swamy) с мед факультета Гарвардского института (Harvard Medical School). В процессе опыта РНК связывают с маленьким пептидом, который выделен из вируса бешенства. Этот гликопротеин избирательно связывается с сенсорами к ацетилхолину на нервных клеточках. Таким макаром, siRNA оказывается на поверхности нейронов и получает возможность просочиться вовнутрь. В опытах на животных этим методом удалось одолеть смертельный энцефалит. «Заякорить» РНК можно не только лишь на белковых молекулах, да и на липидах либо искусственных полимерах. Остаётся только убедиться, что такие «носители» нетоксичны для клеток.

Кроме доставки в недоступные органы, много заморочек делают побочные эффекты РНК-терапии. Трудность состоит в том, что побочное действие может быть правильно проследить исключительно в ходе внедрения нового лекарства на человеке: опыты на животных в данном случае дают только ориентировочные познания или выявляют только самые томные побочные эффекты.

Невзирая на многие трудности, разработка РНК-терапии стоит того, ведь она позволяет оказывать влияние на работу органов на самом узком уровне — на уровне генов. Изменение ситуации «в корне», на самых ранешних ступенях — пока самый надёжный метод исцеления от тяжёлых недугов, единственная надежда многих миллионов людей.

Виола Брик