Белки в свете рентгеновских лучей

Белки — это полимерные молекулы, которые представляют собой цепочку аминокислот. Аминокислоты бывает 20 видов. Последовательность этих аминокислот для каждого белка записана в нашем генетическом коде, который достается нам от родителей.

1. Функции белков

Почти все, что умеют делать наши клетки и весь наш организм, — это работа белков. Белки занимаются обменом веществ, они обеспечивают работу мышц. Электрические импульсы, которыми обмениваются наши нервные клетки, тоже являются результатом деятельности белков, создающих электрический ток.

Хотя в самом генетическом коде белка содержится информация о том, какую форму он примет, до сих пор никто не научился предсказывать по первичной последовательности формы белка его пространственную структуру. Для того чтобы белок работал, он должен свернуться правильным образом. То, как он работает, определяется в значительной степени этой структурой.

Финкельштейн А.В., Птицын О.Б. Физика белка. 2012. М.: КДУ. 524 с.

2. Структура белков

На сегодняшний день известны геномы человека, других животных, растений, известны даже индивидуальные геномы некоторых людей, включая открывателя двойной спирали ДНК Джима Уотсона. Однако структуры белков известны гораздо хуже. На сегодняшний день в банке данных белковых структур их примерно 88 000, из которых только несколько тысяч действительно различные, а остальные — модификации известных белков.

Для того чтобы понять, как работает белок, нужно посмотреть, как он собран. Известно, что некоторые аминокислотные замены, то есть мутации, вызывают определенные наследственные болезни. Пока мы не знаем, где находится эта аминокислота, как она встроена в работу белка, трудно понять, почему мутация вызывает болезнь и как ее лечить.
Почти все существующие лекарства — это маленькие молекулы, которые взаимодействуют с белками. И для того чтобы создавать новые лекарства, очень полезно знать пространственную структуру белковых молекул-мишеней, к которым подбираются лекарства.

3. Процесс изучения структуры белка

90% всей информации о структуре белков было получено с помощью рентгеновской дифракции. Чтобы получить дифракционные картинки, нужно в первую очередь кристаллизовать белок. Для этого берут очищенный белок, создают в специальных условиях раствор, в котором он выпадает в виде кристалликов. На дне, так же как в испаряющейся чашке сладкого чая появляются молекулы сахара, выпадают кристаллы. Потом эти кристаллы помещают в рентгеновский луч. Ученые используют именно рентгеновский, а не обычный свет, поскольку нас интересуют атомные размеры, размеры порядка 1/10000 микрона. Видимый свет — это чуть меньше микрона. Поэтому для того, чтобы посмотреть на такие мелкие объекты, нужен свет с очень короткой длиной волны. Таким свойством как раз и обладают рентгеновские лучи.
Затем в этот пучок помещается кристалл, за ним раньше ставили фотопленку, а теперь — детекторы (примерно такие, как в цифровых фотоаппаратах, только более крупные и более дорогие). И на экране появляется картина рассеяния фотонов на кристалле света. Кристалл поворачивают под разными углами к рентгеновскому лучу и собирают картину рассеяния для всевозможных ориентаций.

Владимиров Ю.А. Зачем нужна белковая кристаллография. Природа. 2003 № 11. 26-34.

4. Рассеивание фотонов

Рентгеновские лучи частично рассеиваются и отражаются плоскостями кристалла и дают, кроме прямого луча, еще преломленный. Этот луч оказывается ярким в зависимости от угла между исходным лучом и кристаллической решеткой и от расстояния между кристаллическими плоскостями. Чем ближе это расстояние, тем дальше отклоняется луч. Количество ярких пятен или рефлексов на рентгенограмме белка исчисляется десятками тысяч.
Таким образом, когда мы подставляем его под разными углами, мы получаем более-менее полную картину, которую потом необходимо собирать из этой мозаики.

5. Использование синхротронов для получения белковых кристаллов

Получение первых белковых кристаллов, за что авторам эксперимента — Кендрю и Перуцу — была дана в 1962 году Нобелевская премия, заняло у исследователей двадцать лет. Это были кристаллы миоглобина и гемоглобина. Им пришлось придумать и аппаратуру, и методы анализа этих рентгенограмм.

На сегодняшний день этот процесс уже более автоматизирован. Он делается гораздо легче, чем раньше, поскольку рентгеновские источники изменились. Сейчас в качестве таких источников используют синхротроны [3, 4]. Это ускорители, в которых электроны двигаются по почти круговой траектории. Каждый раз, чтобы удержать их на орбите, надо повернуть их магнитным полем. Каждый раз, когда летящие электроны меняют направление движения, они излучают электромагнитные волны. Если энергия этих электронов достаточно большая, то есть их скорость достаточно близка к скорости света, то в том свете, который они излучают, очень много рентгеновских фотонов. Дальше из этого разноцветного света выбирают и вырезают узкую полосу волны, чтобы получить рентгеновские лучи с фиксированной длиной волны. Затем их фокусируют и направляют на интересующий объект.

Современные синхротроны иногда называют «фотонной фабрикой». На каждом магните, где поворачивается луч, его разбирают на рентгеновские пучки, туда ставятся детекторы, и там группа ученых 24 часа в сутки, 7 дней в неделю получают какие-то данные.

Huxley H.E. and Holme K.C. Development of Synchrotron Radiation as a High-Intensity Source for X-ray Diffraction. J. Synchrotron Rad. (1997). 4: 366-379.

6. Получение белковых кристаллов

На сегодняшний день самым сложным этапом остается получение белковых кристаллов, поскольку некоторые белки очень плохо кристаллизуются. Способность кристаллизовать важный и нужный белок — это целое искусство.
Но проблема состоит в том, что среди белков, находящихся в базе данных, очень мало белков, которые в норме живут внутри мембран. Такие белки плохо растворяются, потому что они торчат одной стороной наружу клетки, другой — внутрь клетки, но в середине они покоятся в «жирной» клеточной мембране. Они очень плохо растворяются, и из них очень трудно получать кристаллы.

Получение первого кристалла ионного канала, а тем более для того, чтобы достичь нужного разрешения (чуть меньше 2 ангстрем), у Родерика Маккинона заняло больше десяти лет, просто чтобы получить кристалл нужного качества. За этот труд в 2003 году он получил Нобелевскую премию. Это был находящийся в мембране белок, который открывает пору, сквозь которую проходят ионы калия. Чтобы понять, почему он пропускает только именно ионы калия, а не более маленькие ионы натрия, ему понадобилось разрешение чуть меньше 2 ангстрем. Казалось бы, как это может быть? Тем не менее этот кристалл, эта структура позволили ему это объяснить.

В базе данных существует чуть больше сотни таких мембранных белков. Их очень мало, потому что они очень плохо кристаллизуются. И именно они и являются теми самыми интересными молекулами-мишенями, потому что они являются рецепторами, торчащими из клетки, на которые могут быть направлены лекарства.

Sawaya M.R. et al. Protein crystal structure obtained at 2.9 Å resolution from injecting bacterial cells into an X-ray free-electron laser beam.Proc Natl Acad Sci U S A. 2014 Aug 18. pii: 201413456. [Epub ahead of print]

7. Рентгеновские лазеры на свободных электронах

В конце 2012 года появились первые публикации, в которых первые белковые структуры были получены на американском ускорителе нового типа — рентгеновском лазере на свободных электронах. В 2015 году будет запущен европейский ускоритель, в котором Россия принимает серьезное участие. Он строится в Гамбурге, но четверть финансов на его строительство вложено Россией. К тому же на нем работает большое количество российских ученых и ученых российского происхождения.

Это устройство длиной в несколько километров и есть так называемый рентгеновский лазер на свободных электронах. Сначала электроны разгоняются в нем до околосветовой скорости, а потом они попадают в очень длинную линейку из магнитов с чередующейся полярностью. И когда электрон туда попадает, магнитное поле его отклоняет то в одну, то в другую сторону, и он начинает двигаться по змейке. И эта змейка устроена так, что каждый раз, когда электрон поворачивает, он излучает электромагнитные волны. Сами эти электромагнитные волны влияют на электроны. В результате этого у нас есть не шнур из текущих по змейке электронов, а такие бусы, где расположены сгустки электронов на достаточно большом расстоянии друг от друга.

И в результате получается свет с невероятной интенсивностью. Если синхротронное излучение примерно в 10 млрд раз ярче, чем дают лабораторные источники, то яркость луча этого рентгеновского лазера на свободных электронах еще в 10 млрд раз больше, чем у синхротрона.

Теперь ученые собираются бросать в этот ускоритель одиночные молекулы. Они будут встречаться с рентгеновским пучком и мгновенно испаряться. Но поскольку длительность вспышки очень короткая — где-то десятки фемтосекунд, то есть одной стомиллионной от одной миллионной секунды, — за время вспышки, даже превратившись в плазму с температурой в десятки тысяч градусов, эти электроны и ионы никуда не успевают улететь. Поэтому того, что мы изучали, уже нет, оно превратилось в плазму, но на экране осталась картина, рассеянная этим объектом. И теперь ученые собираются бросать туда одинаковые молекулы, которые будут случайным образом в луче поворачиваться. Если набрать десятки тысяч таких изображений, то из них можно в перспективе собрать структуру самого объекта.

Такие опыты на одиночных молекулах — это дело не очень далекого будущего. На чуть менее мощном, чем европейский, но начавшем работать с конца 2011 года американском лазере уже было получено несколько структур микрокристаллов белков. Совсем недавно, в августе 2014 года, там была получена структура токсина, находящегося в бактериях в виде микрокристаллов. Для этого бактериальные клетки с находящимися в них микрокристаллами бросали в луч рентгеновского лазера, а затем собирали и анализировали многочисленные дифракционные картины, в которых и клетки, и кристаллы были случайным образом ориентированы по отношению к рентгеновскому лучу.